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    对青岛百合(Lilium tsingtauense Gilg)复合种群6个部分种群的遗传多样性举行了RAPD剖析。经由进程11个引物扩增到117个显性位点,此中多态性位点均匀为62.86%,各百合集体多态性位点若干挨次为Y5、Y1、Y4、Y6、Y2、Y3。把RAPD多样性目标与样地的根蒂根基情形举行相干剖析,发觉海拔高度、样地坡度和植被范例与各个多样性目标呈正相干,样地坡向与各个多样性目标呈负相干。Nei’s基因多样度指数(h)和Shannon信息指数(I)的统计了局表白,种群内h和I的均匀值别离为0.203 4和0.309 0,这两个指数均为Y5最高,其次为Y1,Y3最低。差别位点在种群间的分解程度差别很大,基因分解度的颠簸规模为0.016 5~0.942 7,均匀为0.378 3。种群间均匀基因流为0.821 6,阐明 顺叙有遗传漂变的具有。6个百合种群间遗传统一度与遗传间隔的无偏估计表白,最小的遗传间隔在Y4和Y6之间,最大的遗传间隔在Y3和Y5之间,遗传统一度则相同。种群聚类剖析表白,Y1和Y2比拟近;Y4和Y6比拟近又和Y5联络在一起。Y3比拟不凡,独自为一类。  关键词青岛百合(Lilium tsingtauense Gilg);复合种群;遗传多样性;RAPD;遗传漂变;遗传间隔  中图分类号S682.2; 文献标识码A 文章编号0439-8114(2014)13-3074-04  RAPD Analysis of Genetic Diversity of the Lilium tsingtauense Metapopulation  ZHANG Cong-min1,ZHANG Zhi-guo2  (1. School of Biological Science and Biotechnology, Minnan Normal University, Zhangzhou 363000, Fujian, China;  2. School of Life Sciences, Shandong University, Jinan 250100, China)  Abstract Genetic diversity of six Lilium tsingtauense metapopulations were studied with the method of RAPD. The genetic differentiation among populations was analyzed by STATISTICA. 117 loci were amplified by RAPD. The means of genetic diversity within population was 62.86%. The order was population 5> population 1> population 4> population 6> population 2> population 3. Altitude, plot slope, vegetation types and various diversity index was positively correlated. But plots slope and various diversity index was negatively correlated. The result of Nei’s gene diversity index (h) and Shannon(I) Information showed that the mean was 0.203 4 and 0.309 0. These two indices were both the highest in population 5, but the lowest in population 3. Genetic divergence of all RAPD loci among populations was different from 0.016 5 to 0.942 7, with the mean of 0.378 3. The change of gene flow was inverse to the change of genetic divergence. The means of gene flow was 0.821 6, less than 1, indicating that there was genetic drift among populations. From Nei’s unbiased measures of genetic identity and genetic distance by RAPD, it was conducted that the lowest genetic distance was between population 4 and population 6, with the highest genetic identity between them.  Key words Lilium tsingtauense; metapupulations; genetic diversity; RAPD; genetic drift; genetic distance  青岛百合(Lilium tsingtauense Gilg)是我国百合科的特有种,已列入第二批国度庇护动物名录[1]。因为栖身地干扰的加重,青岛百合的散布规模日益淘汰,目前,青岛百合的集中散布地位于崂山北九水以南海拔400~1 000 m的丛林群落内,这一区域可见到成片散布的种群,均呈斑块状散布,斑块之间的间隔依地形、地貌及人类活动的强度差别而远近不一,以复合种群具有[2]。 目前对百合的研讨在海内已有不少报道,次要集中在其地理散布、化学成份、组织培养、细胞学视察及杂交育种等方面,但鲜见关于青岛百合的研讨。一个物种的不变具有与其集体的遗传多样性程度和遗传布局亲密相干[3],因而对青岛百合遗传布局的研讨将有助于会商其濒危原因及进程,采取科学无效的措施举行庇护,并且能为其分类、进化研讨供应资料,进而为育种和遗传改良供应遗传学依据。RAPD技巧是一种简捷、快速、易行的份子标识表记标帜技巧,实行用RAPD技巧剖析了青岛崂山6个样地(Y1~Y6)的青岛百合复合种群的遗传多样性、集体内和集体间的遗传变异,旨在为青岛百合遗传布局的研讨供应依据。  1 资料与方式  1.1 资料  实行从6个样地(Y1~Y6)各随机取20株青岛百合的幼嫩顶芽,敏捷置于冰盒中带回实行室于4 ℃保留,7 d内举行总DNA的提取。  1.2 方式  1.2.1 基因组DNA的提取 6个样地共120份样品,采纳十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[4]稍作修正 休学后提取基因组DNA,经由进程琼脂糖凝胶电泳,LALBWORKS3.0成像,Labimage2.6剖析确定各梯度的DNA浓度和纯度,-20 ℃保留备用。  1.2.2 引物的挑选 从Operon公司30个引物中挑选出7个产品不变、多态性高、模板浓度适应性强的引物;从Sangon公司的20个RAPD引物中挑选出4个,在Sangon公司合成,并与挑选用引物对比,扩增了局统一。共用引物11个,序列见表1。  1.2.3 RAPD扩增 参考Koppitz[4]和Hofstra等[5]的方式,经由进程对反映体系中各成份的优化,树立了最佳反映体系,总体积25 μL。包括60 ng基因组DNA,10 pmol随机引物,2.5 mmol/L dNTP、1U Taq DNA聚合酶,25 mmol/L MgCl2等。反映法式为94 ℃变性1 min,35 ℃复性1 min,72 ℃延伸2 min,40个轮回;最初72 ℃延伸7 min。扩增反映在德国BIOMETRA-GRANDIENT PCR仪上举行。  1.3 RAPD数据的统计  1.3.1 多态性位点比例(P) P=多态性位点数/位点总数,对某一位点,隐性频次(q)和显性频次(P)均超过0.05即记为多态性位点。  1.3.2 Nei’s基因多样度指数(h) 对某一位点,h=1-(p2+q2);对某一种群,种内基因多样性 Hs(Nei’s)=∑h/n,此中n为位点总数;种群总基因多样度HT=∑[1-(pi2+qi2)]/n,此中n为位点总数,pi和qi别离为总的种群中i位点上的显性频次和隐性频次。  1.3.3 Shannon信息指数(I) 对某一位点,I=-∑(log2Xi)xi,此中Xi为该位点上第i个等位基因的频次。  1.3.4 种群间基因分解度 GST=(HT-HS)/HT  1.3.5 基因流 Nm=0.5(1-GST)/GST  2 了局与剖析  用Popgen32软件包对取得的RAPD“0,1”矩阵举行处置,取得种群遗传多样性和种群遗传布局的根蒂根基信息,再用Statistica对种群间的遗传分解规律举行进一步的统计剖析。11个随机引物扩增到117个显性位点,均匀每一个引物检测到10.64个位点。  2.1 种群内遗传多样性RAPD剖析  由表2可知,种群内RAPD多态性比例(P)均匀为62.86%,这在动物种群中是比拟高的。在一切样地中,Y5的P最高,为69.23%,其次是Y1,为65.18%。Y3的最低,为57.26%,按检测到的多态位点比例排序,各百合集体挨次为Y5>Y1>Y4>Y6>Y2>Y3。  种群内均匀每一个位点的等位基因数(Na)和无效等位基因数(Ne)的均匀值别离为1.629 6和1.339 5。这两个多样性指数仍然是在Y5和Y1两个种群中较高,Y5的Na值最高,Y1的Ne值最高,阐明 顺叙在Y1中等位基因的频次散布绝对均匀一些,而Y5中含有较多频次较低的等位基因。Na和Ne的最低值均出如今Y3种群中,别离为1.572 6和1.283 3。  Nei’s基因多样度指数(h)和Shannon信息指数(I)是测度种群遗传多样性的首要目标。种群内h和I的均匀值别离为0.203 4和0.309 0。前者惟独后者的65.82%,这两个指数均在Y5中最高,其次是在Y1中较高,在Y3中最低。别的,包含一切种群的总的遗传多样性较着高于任何一个种群内的遗传多样性,阐明 顺叙有相称的遗传变异具有于种群之间。  由表3和图1可知,海拔高度、样地坡度和植被范例与各个多样性目标呈正相干,即跟着海拔的升高、样地坡度的添加和植被范例复杂程度的添加,各个多样性目标值添加;别的,样地坡向与各个多样性目标呈负相干,即阴坡比阳坡的各个多样性目标高,这合乎青岛百合合适阴湿环境的情形。Na值下降,而Ne、I、h值升高,相同地,跟着样地植株数添加,多样性目标的P、Na值升高,而Ne、I、h值下降。  2.2 种群间的遗传布局与遗传分解  2.2.1 种群间的遗传分解 差别位点在种群间的分解程度差别很大,最极其的情形是不分解(GST=0)和完全分解(GST),除掉这两种极其情形,RAPD位点上基因分解度的颠簸规模为0.016 5~0.942 7,最小值的位点为OPD05-1,最大值的位点为OPQ09-4。基因流的转变趋向与基因分解度相同,基因分解度越高,基因流越小,基因流的颠簸规模为0.028 0~29.808 9。  差别位点上基因分解度的差别如斯之大,也许与空间隔离的种群在差别生境中发生新的体细胞渐变无关。  一切位点基因分解度的均匀值为0.378 3,阐明 顺叙对研讨的6个百合种群来讲,有37.83%的基因多样度具有于种群间,62.17%的基因多样度具有于种群内。种群间均匀基因流为0.821 6,略小于1,阐明 顺叙有遗传漂变的具有。 2.2.2 种群间遗传布局与遗传间隔 表4是RAPD剖析对6个百合种群间遗传统一度与遗传间隔的无偏估计,最小的遗传间隔在Y4和Y6之间,为0.132 6,最大的遗传间隔在Y3和Y5之间,为0.247 0。相同,Y4和Y6之间的遗传统一度最大,为0.875 8,Y3和Y5之间的遗传统一度最小,为0.781 1。  2.2.3 聚类剖析 6个种群的RAPD剖析见图2。从图2能够看出,Y1和Y2比拟近;Y4和Y6比拟近又和Y5联络在一起。Y3比拟不凡,独自为一类。  3 小结与会商  3.1 种群的遗传布局及其影响要素  进化的根蒂根基单位不是个体而是种群,进化等于种群基因库的转变[6]。种群遗传布局等于遗传变异或说基因和基因型在时间和空间上的散布模样形状。对动物集体遗传布局及其影响因子的研讨是集体遗传学中的首要课题,是会商动物的适应性、物种构成进程和模样形状及其进化机制的根蒂根基,也是庇护生物学的中心。  种群遗传布局是一个物种最根蒂根基的特性之一,它受渐变、基因流、挑选和遗传漂变的配合作用,同时还和物种的进化汗青和生物学特性无关,本实行了局表白差别位点在种群间的分解程度差别很大,也许与空间隔离的种群在差别生境中发生新的体细胞渐变无关。青岛百合种群间的均匀基因流为0.821 6,略小于1,阐明 顺叙有遗传漂变的具有。别的,基因流的转变趋向与基因分解度相同,如果说天然挑选是招致种群分解最次要的进化力气,那么基因流则是对抗挑选作用的首要要素[6]。在动物中,基因流是借助于花粉、种子、孢子、营养体等遗传物质携带者的迁徙或活动来完成的,青岛百合也许是经由进程水流带动种子的活动,这些配合影响着青岛百合的遗传布局。  3.2 青岛百合遗传布局研讨中份子标识表记标帜的挑选  青岛百合作为我国百合科的特有种,已列入第二批国度庇护濒危动物名录[1]。因而,研讨青岛百合的遗传布局对庇护青岛百合具有首要意思,在此准确挑选份子标识表记标帜非常首要。目前用于研讨动物遗传标识表记标帜有等位酶、RAPD、ISSR、AFLP、STS等,对同一问题,差别标识表记标帜取得的了局也许差别,为了客观反映种群的天然情形,应仔细研讨所要解决的问题和可供挑选的份子标识表记标帜的特性,以保障所选的份子标识表记标帜对解决所研讨的问题为最佳挑选。  对个体差异灵敏度高的份子标识表记标帜如RAPD、ISSR、DAF(DNA指纹)等用于中、小尺度上遗传变异的研讨也许取得较好的了局,这些变异用于检测种群遗传变异的时间静态特性也比拟合适。因为青岛百合成斑块状散布,散布规模较狭窄,再加上现有的实行设备,选用RAPD技巧可取得不变而可靠的了局。  3.3 对青岛百合复合种群的庇护提议  1)应在青岛百合散布区崂山北九水天然风景区执行真正意思的限额采伐,某些地区应克制采伐和开发,实际上自从划出禁游区以来整个青岛百合种群有茂盛的趋向。  2)将青岛百合散布较密集、成长较好地区划为以青岛百合为重点的省级天然庇护区,对青岛百合执行当场庇护。克制在庇护区内采伐、放牧,教诲本地农牧民树立庇护天然等于庇护人类的思维,淘汰报酬活动对它的破碎摧毁。  3)在对青岛百合当场庇护的同时,踊跃向合适其成长的环境中引种,执行迁地庇护,添加野生种群数目。按照在青岛、海阳、即墨动物园的栽培情形,能够推断在青岛地区均可引种青岛百合。  4)在现有研讨根蒂根基之上,对青岛百合复合种群应继承举行跟踪研讨。青岛百合种群具有年齿易确定、散布区集中、散布区域明白等特性,是研讨动物复合种群很好的资料。继承对青岛百合复合种群空间格局及繁殖、迁徙等静态进程举行跟踪研讨,不只使得青岛百合复合种群的研讨愈加完满,加强对这一海内特有种的庇护,而且对其余动物的复合种群研讨也将有首要的指导意思。  参考文献  [1] 王仁卿,张昭洁.山东稀有濒危庇护动物[M].济南山东大学出版社,1993.  [2] 张聪敏,王仁卿,张治国.青岛百合生境特性和散布近况研讨[J]. 湖北农业科学,2010,49(6)1404-1410.  [3] 夏 铭,周晓蜂,赵士洞.天然红松林集体遗传多样性的RAPD剖析[J].生态学报,2001,21(5)730-737.  [4] KOPPITZ H.Analysis of genetic diversity among selected populations of Phragmites australis world-wide[J].Aquatic Botany, 1999,64(3-4)209-221.  [5] HOFSTRA D E,CLAYTON J.RAPD profiling and isozyme analysis of New Zealand Hydrilla verticillata[J]. Aquatic Botany,2000,66153-166.  [6] GRANT V.The Evolutionary ProcessA Critical Study of Evolutionary Theory[M].New YorkColumbia University Press,1991.

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